domenica 28 agosto 2011

Regolazione della crescita laminare e compartimentale dei dendriti nella corteccia matura


I dendriti sono degli integratori dinamici degli input sinaptici che giungono al soma del neurone.  Le loro proprietà al riguardo sono strettamente dipendenti dal modello di ramificazione dell’albero dendritico.  Nei topi la forma finale dell’albero dendritico si completa nelle prime due settimane di sviluppo post-natale, periodo in cui si ha una notevole quantità di impulsi afferenti e formazione di sinapsi. Successivamente la struttura dendritica su larga scala è notevolmente stabile. 
La via di segnalazione PI3K/PTEN regola l’ipertrofia dei dendriti nello sviluppo della corteccia, ma il suo ruolo nella corteccia matura non è chiaro. Per esaminare direttamente la potenzialità, le dinamiche e i meccanismi molecolari della crescita dendritica nella corteccia matura in vivo, bisogna generare dei topi con delezione condizionale del gene oncosoppressore PTEN (αCamKII-Cre + / -; Ptenloxp / loxP; Thy1-GFP). La delezione del gene aumenta significativamente attorno all’ottava settimana dopo la nascita dei topi. Vengono poi ripresi nella loro interezza i neuroni degli strati corticali II e III di tutto il cervello di topi dell’età di 3-4 mesi e vengono ricostruiti nelle 3 dimensioni. I dendriti apicali dei neuroni dei topi PTEN -/- sono molto più lunghi e tortuosi dei dendriti corrispettivi del campione di controllo. 

Crescita compartimento-specifica dei dendriti
La lunghezza totale dell’arborizzazione apicale è in media di 1,6 mm in più nei topi PTEN -/- , con un ampliamento di circa l’80% della struttura dendritica apicale normale. D’altro canto la lunghezza e la tortuosità dei dendriti basali degli stessi neuroni non sono significativamente modificate dalla delezione di PTEN, né si riscontra una differenza nella densità delle spine dendritiche tra i due gruppi (densità: 7,3 ± 0,8 spine per 10μm nei controlli vs 7,5 ± 0,9 spine per 10μm in PTEN-/ -, p = 0,29 n = 1798 spine nel controllo e 1989 in PTEN-/ -). Tutti i neuroni ripresi in topi PTEN-/ - hanno mostrato segni di una robusta crescita dendritica apicale. Per esaminare la cinetica della crescita dei dendriti apicali vengono ripresi ripetutamente i dendriti in vivo.  L’attività di imaging inizia tra la settima e l’ottava settimana di vita del topo quando l’espressione corticale di Cre subisce un brusco aumento nei topi Cre +/-.  I dendriti apicali degli strati II e III della corteccia dei topi di controllo sono stabili se ripresi a intervalli di un mese, anche se piccoli allungamenti o retrazioni possono essere rilevati, non ammontano a più del 1-2% della lunghezza totale dei dendriti.
In topi PTEN -/- i dendriti apicali dei neuroni piramidali ripresi tra la settima e l’ottava settimana d’età non sono significativamente differenti da quello del campione di controllo della stessa età né vi è alcuna differenza nella densità delle spine dendritiche. A distanza di un mese però i dendriti apicali dei topi PTEN -/- crescono di centinaia di micron, ampliando l’arborizzazione dendritica dal 24% al 62% per neurone sia dello strato II che dello strato III della corteccia. 
Dinamica della crescita dendritica apicale in vivo

Questa crescita si verifica sempre dalle punte dei dendriti esistenti ed è caratterizzata dalla presenza di sporgenze  simili a filipodi sulle punte di crescita. La densità delle spine dendritiche non diminuisce significativamente nei primi 150 micron delle regioni appena formatisi eccetto che nelle porzioni più distali con l’aggiunta complessiva di 220-404 nuove spine per neurone. Queste nuove spine dendritiche sono molto labili e si formano e disfano con una velocità doppia rispetto al normale, situazione simile al primo periodo post-natale in cui i circuiti corticali sono raffinati dall’esperienza.  Le regioni dendritiche con una densità di spine minore di 2 spine per 10 micron vengono retratte. Questa retrazione è associata alla presenza di grandi rigonfiamenti vicino alla punta dei dendriti che sono simili all’aspetto dei “bulbi da retrazione”  descritti alla punta degli assoni dei motoneuroni che poi scompaiono.  Così l’innervazione sinaptica, o almeno la presenza delle spine dendritiche, è richiesta nel mantenimento delle nuove spine dendritiche come anche nello sviluppo della corteccia.
La carenza di PTEN porta ad una maggiore attività della chinasi mTOR e a un concomitante incremento dell’attività della chinasi S6 con conseguenze traslazione delle proteine e crescita cellulare.  Iniezioni giornaliere di rapamicina antagonizzano la segnalazione di mTOR corticale in vivo e impedisce completamente l’abbondante crescita dendritica che si ottiene con la delezione di PTEN. Nei topi di controllo invece la rapamicina non ha alcun effetto sulla lunghezza dei dendriti poiché agisce solo su arborizzazioni in crescita. Per dimostrarlo si rilevano immagini in vivo dei neuroni per quattro settimane dopodiché, quando la crescita dei dendriti diviene più rapida, si effettua il trattamento con rapamicina e si continua l’attività di imaging per altre quattro settimane. Appena una settimana dopo il trattamento la crescita si arresta e le protrusioni simili a filipodi all’estremità dei dendriti scompaiono; anche la densità delle spine dendritiche sulle nuove porzioni di dendriti diminuisce. Il trattamento prolungato di rapamicina comunque non porta a un accorciamento dei dendriti nelle loro porzioni neoformate, mentre una volta sospeso il trattamento la crescita riprende in modesta entità.
Effetti della rapamicina

I neuroni piramidali dello strato V della corteccia dei topi PTEN -/- non mostrano alcuna differenza apprezzabile nella crescita dei dendriti apicali né nella densità e nella cinetica delle spine dendritiche rispetto al campione di controllo. La rtPCR e le colorazioni immunoistochimiche confermano l’assenza dell’RNA e della proteina PTEN nei neuroni piramidali del V strato corticale nei topi PTEN -/- e sono nulli gli effetti della rapamicina. Quindi la via di segnalazione PTEN/mTOR non regola la crescita dei dendriti nel V strato corticale.
In sintesi : i dendriti mantengono la capacità di crescita su larga scala in tutta la corteccia; i dendriti in crescita si comportano come i dendriti nella corteccia più giovane e infine la via di segnalazione PTAN/mTOR agisce soltanto sui dendriti apicali degli strati II e III della corteccia matura.

References
1. Hausser M, Spruston N, Stuart GJ. Diversity and dynamics of dendritic signaling. Science. 2000;290:739–744. 
2. Wong RO, Ghosh A. Activity-dependent regulation of dendritic growth and patterning. Nat Rev Neurosci. 2002;3:803–812. 
3. Cline HT. Dendritic arbor development and synaptogenesis. Curr Opin Neurobiol. 2001;11:118–126.  
4. Chow DK, Groszer M, Pribadi M. Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex. Nat Rev Neurosci.2009; 12(2): 116–118.

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